Buněčné linie ve studiu rostlinné epigenetiky

4.4.2022 |

Ještěže ten Gregor Johan nejprve sáhl po hrachu. Kdyby začal s pozdějšími jestřábníky… Sotva kdo z biologických výzkumníků asi zpochybňuje význam spolehlivých a čitelných modelových organismů pro rozvoj vědy – a tím i následné praxe. Hrách postupně v laboratořích nahradil zejména huseníček, jinde klasické cévnaté rostliny nahradily mechorosty, či dokonce řasy. Metodicky jsou výhodnější pro to či ono. Jejich biologie je v mnohém jednodušší, nicméně v řadě detailů svých molekulárních mechanizmů „jiná“. Co použít místo nich?

Už v prehistorii moderních rostlinných biotechnologií nacházíme snahy onu strukturálně i metabolicky složitou rostlinu tvořenou nejrůznějšími orgány, pletivy ba i buňkami nějak zjednodušit. Prvotním cílem před více jak půlstoletím bylo vytvořit z výchozích „kalusových“ kultur ty „suspensní“, prakticky využitelné zejména ve farmacii. Motivováni úspěchy svých kolegů, pracujícími s tkáňovými kulturami živočišnými, upjali se i rostlináři později k vizi vytvořit také jakési modelové HeLa buňky - tedy nesmrtelné populace potomstev nádorové tkáně děložního čípku jisté Henrietty Lacs. Ta sice své nemoci podlehla již v roce 1951, ale původně její buňky žijí dál v tisících laboratoří po celém světě. Její (byť lidsky jistě smutný) přínos moderní vědě cytologické, cytogenetické a molekulární lze označit jako nevyčíslitelný. Právě tak jako medicinský dopad mnoha dalších živočišných buněčných linií až po ty nejmodernější mutanty, hybridomy atp.

Většina z nich se vyznačuje unikátní cytologickou a fyziologickou homogenitou a nabízí nám mimo jiné možnost, obdobně jako u mikroorganismů, synchronizovat jejich růst, dělení, ontogenezi, diferenciaci. Dosáhnout obdobných parametrů u materiálu rostlinného se však bezmála dalších dvacet let z mnoha důvodů základní biologické odlišnosti obou říší (viz blíže Opatrný et al. 2014) nedařilo. Takže za první rostlinný HeLa cell-like model můžeme označit až buněčnou linii VBI-0 odvozenou v roce 1967 v pražském Ústavu experimentální botaniky Československé akademie věd (ÚEB ČSAV) (Opatrný a Opatrná 1974).

Název dostala podle své mateřské rostliny – tabáku odrůdy Virginia Bright Italia. Byla a je ideálním modelem pro nejrůznější molekulární, biochemická i cytologická studia od výzkumu rostlinného hormonálního metabolismu a jeho funkcí v ontogenezi či stresových reakcích až po problematiku struktury a funkce cytoskeletu. Ale je hodně náročná na pěstování a v méně „zelených rukou“ molekulárních analytiků či vůbec chemiků se jí moc nedaří. Prostě model pro fajnšmekry.

Takže na vítěznou cestu světem se až opět o dvacet let později vydala její mladší, opět tabáková sestra. Narodila se v Japonsku a té pražské je cytologicky i růstovými nároky až neuvěřitelně podobná. Ale měla drsné mládí a to jí dalo vlastnosti pro opravdu rutinní použití. Odvozená je od kultivaru Bright Yellow, nese tedy název BY-2. Původně se vlastně jednalo o neúspěšný produkt projektu, jenž měl průmyslově vyrábět biomasu pro beznikotinové cigarety, leč vědecký pánbůh rozhodl jinak (Nagata 1992).

V řadě světových laboratoří – včetně našich, zejména na ÚEB AVČR nebo na Přírodovědecké fakultě Univerzity Karlovy (PřF UK) - už obě linie dlouho bydlí pospolu.. Jejich výzkum je předmětem publikací v těch nejprestižnějších časopisech, ale také řady recentních diplomových či doktorandských prací. Dlouhodobými tématy jsou, jak již řečeno, zejména role klíčového rostlinného hormonu auxinu v růstu a vývoji rostlin. Atraktivní problematikou, spadající i do oblasti evoluce cévnatých rostlin, je studium různých hormonálních přenašečů, zejména tzv. PINů. A pak nejspíš fungování cytoskeletu a dalších návazných struktur.

V současnosti je využívána i celá paleta různých sublinií cíleně mutovaných či transformovaných. Sám genom BY-2 je už poměrně precizně znám a zanesen v příslušných databázích. Pokračuje výzkum transkriptomu „rodin“ BY-2 a VBI-0. A v posledních letech se, v celku logicky, rozvíjí i studium jejich epigenetiky.

Klíčovým přínosem těchto modelů je pro ně již zmíněná možnost přípravy materiálu, nacházejícího se v určité fázi buněčného cyklu. Již po více let je kupř. tým Dr. Fischera z Katedry experimentální biologie rostlin PřF UK využívá ve studiu regulace genové exprese pomocí malých RNA. Ať už v kontextu se standardní rostlinnou ontogenezí nebo s umlčováním různých transgenů do modelových kultur vložených. Sledován je její průběh jak na úrovni transkripční, tak translační. Novou oblastí výzkumu je pak studium role různých epigenetických mechanismů v průběhu, resp. účinnosti moderních technik precizní mutageneze – zejména systémů typu CRISPR/Cas9.

První publikace těchto výsledků jsou v této chvíli ve fázi „putování po redakcích významných časopisů“. Nicméně mnohé se lze dozvědět z některých na podzim úspěšně obhájených doktorských prací (Přibylová, 2021; Čermák 2021).

Citujme z úvodu jedné z nich: „… při transkripčním genovém umlčení (TGS) je genová exprese regulována přes epigenetické modifikace chromatinu. Jednou z epigenetických značek je metylace cytosinu, která je ustanovována především drahou RNA-dependentní DNA-metylace (RdDM). Ačkoliv byl proteinový aparát relativně dobře popsán, o dynamice klíčové počáteční fáze tohoto procesu bylo známo jen málo …“, pokračující: : „…Proto jsme vyvinuli systém, který nám umožnil studovat tento jev v detailu. Použili jsme homogenně reagující buněčnou linii BY-2 a v kombinaci s indukovatelným systémem pro řízenou produkci malých RNA jsme spouštěli de novo RdDM. Naše výsledky ukazují, že metylace DNA související s TGS byla rychlejší, než se dříve uvádělo. V dělící se buněčné kultuře se metylace DNA rovnoměrně zvyšovala až postupně během dvou dnů plně inhibovala aktivitu promotoru cíleného malými RNA. V naší studii zaměřené na umlčení na posttranskripční úrovni jsme pozorovali, že odlišný původ dsRNA silně ovlivnil produkci sRNA, což vedlo k neočekávaným rozdílům v dynamice a reverzibilitě umlčení a také v rozsahu doprovodné RdDM…“.

Základní výzkum, co vím, tedy zdárně pokračuje. A téma „… kterak mohou spontánní, možno říci nechtěné epigenetické změny, či ty chtěné, cílené, ovlivnit přesnost a účinnost krisprovacích technik ...“ se samozřejmě jeví jako vysoce atraktivní. Snad tedy k jeho přiblížení pomohou vedle klasických „celorostlinných modelů„ i jejich buněčné linie.

Autorský komentář prof. RNDr. Zdeňka Opatrného, CSc., emeritního profesora PřF UK v Praze.

Zdroje:

Opatrný, Z. , Opatrná, J.: The specificity of the effect of 2,4-D and NAA of the growth, micromorphology, and occurrence of starch in long-term Nicotiana tabacum L. cell strains. Biol. Plant. 18: 359–365, 1976.
Nagata,T., Nemoto, Y., Hasezawa,S. : Tobacco BY.2 cell line as the “HeLa” cells in the cell biology of higher plants.- Int.Rev.Cytol. 132: 1-30, 1992
Opatrný, Z., Nick,P., Petrášek ,J.: Plant cell strains in fundamental research and applications.- pp.455 481, In: Nick,P., Opatrný,Z (eds.) Applied Plant Cell Biology. Cellular Tools and Approaches for Plant Biotechnology . Springer Verlag Berlin Heidelberg 2014
Přibylová, A. : Dynamics of de novo DNA methylation and its impact on transgene expression and CRISPR/Cas9 mutagenesis.- Doktorská práce UKPřF , 17.12. 2021
Čermák, V.: Dynamics and variability of induced transgene silencing in tobacco cell line BY-2.- Doktorská práce UKPřF, 5.11.2021