Jabloně (Malus × domestica Borkh.) patří celosvětově mezi jedny z nejpěstovanějších ovocných dřevin mírného pásu. Jejich plody, jablka, jsou důležitou součástí lidského jídelníčku. Využívají se nejen pro přímou konzumaci, ale i výrobu moštů, džusů, kompotů, dětských přesnídávek, džemů, jakož i čajů a aromat do dalších jídel. Často je zdůrazňován i jejich zdravotní význam, vzhledem k obsahu řady zdraví prospěšných látek, pozitivnímu vlivu na zvýšení imunity organismu a odolnosti vůči stresu. 

Pěstování a šlechtění jabloní však musí zejména v posledních desetiletích čelit mnoha nepříznivým faktorům, počínaje průběžně se měnícími nároky spotřebitelů, přes změny klimatu po škodlivé biotické činitele (hmyz; bakteriální, houbové a virové patogeny). Z ekonomického hlediska představuje celosvětově jednu z největších hrozeb pro produkci jablek bakteriální spála růžovitých, způsobovaná vysoce infekčními bakteriemi Erwinia amylovora. Celosvětově je tento patogen v ovocnářství považován za nejdestruktivnější, napadené části (květy, listy, větve) nekrotizují a často vedou až k úhynu stromu. Nákaza se v sadech rychle šíří za zvýšené vlhkosti při vyšších teplotách, vlivem větru a poškození. K přenosu patogenních bakterií přispívá i hmyz, včetně opylovačů (včel). Další nepříznivou okolností je i široké spektrum hostitelských druhů dané bakterie. Ochrana proti spále růžovitých není nijak zvlášť účinná, spočívá především v preventivních opatřeních jako: pěstování odolných odrůd, okamžitém odstraňování nemocných stromů a ošetření sadů postřiky na základě prognóz šíření tohoto karanténního patogenu.

Významným příslibem pro šlechtění jabloní odolných vůči bakteriální spále růžovitých jsou pokroky v našich znalostech o mechanismech průniku bakterie do rostliny a její kolonizace ve spojení s využitím nových šlechtitelských technik (NBT) v ovocnářství. Touto cestou se vydal i společný tým italských výzkumníků z Výzkumného a inovačního centra, Nadace Edmunda Macha v San Michele all’Adige a University v Udine, který po několikaletém úsilí získal a úspěšně otestoval linie se sníženou vnímavostí k původci spály u dvou moderních odrůd jabloní. 

Přestože patogen E. amylovora využívá pro navození infekce komplexní regulační síť mnoha virulenčních determinant, ukázalo se, že schopnost bakterie navodit u hostitele onemocnění závisí především na jednom jejím efektorovém proteinu, označovaném jako DspA/E. Ten umožňuje bakteriím růst v těle rostliny a pokud se dostane do cytoplasmy rostlinných buněk, specificky se navazuje na receptorové kinázy (RK) rostliny, které se pravděpodobně uplatňují při přenosech signálů z vnějšího prostředí. U jabloní byly nalezeny čtyři proteiny (MdDIPM1 – MdDIPM4) s obdobnou strukturou jako RK, jež by mohly fungovat jako faktory vnímavosti během interakce patogenu s jabloní. Hypoteticky by tedy cílená změna struktury vazebného místa v MdDIP mohla narušit vazbu s DspA/E, a tím snížit vnímavost stromů k patogenu.

Italští badatelé se proto ve své práci zaměřili na jeden protein (MdDIPM4) zodpovědný za vnímavost jabloní k chorobě. Pro cílenou změnu (bodovou mutaci) v odpovídajícím genu využili NBT techniku CRISPR/Cas9, při které se u rostlin s výhodou využívá směřování ribonukleoproteinového komplexu Cas9 s naváděcí (g)RNA přímo do protoplastů. Tento komplex je po navození mutací v příslušném genu stráven, a takto editované protoplasty pak neobsahují žádné cizí geny. Vzhledem k tomu, že u jabloní není dosud vypracována účinná metoda regenerace rostlin z protoplastů, museli výzkumníci postupovat komplikovanější cestou „klasické“ transformace rostlinných buněk prostřednictvím bakterií Agrobacterium tumefaciens nesoucích plasmid s potřebným vektorovým konstruktem. Nevýhodou je, že při této alternativě se část genů konstruktu zabudovává do rostlinné DNA, výsledkem je pak geneticky modifikovaný organismus (GMO). Pomocí některých technik je možné tuto nežádoucí informaci odstranit, stejně tak lze vybírat jedince, u nichž samovolně došlo k jejímu vyštěpení v dalších generacích. Obojí však prodlužuje dobu potřebnou pro získání rostlin upravených požadovaným způsobem a pro ověření jejich statutu, tedy, jedná-li se o NBT nebo GMO. 

Nicméně, i přes tyto obtíže, řešitelé získali celkem 57 editovaných linií (27 od odrůdy Gala a 30 od odrůdy Golden Delicious), se změnami v genu MdDIPM4. Tyto změny většinou spočívaly v malých či větší ztrátách genetické informace, tedy nukleotidech genové DNA, méně často v jejich náhradách nebo přidáních. Z uvedené kolekce změn výzkumníci vybrali sedm linií, u nichž došlo ke ztrátě funkce genu MdDIPM4 a neobsahovaly žádný cizorodý genetický materiál. Uvedené linie byly společně s kontrolními, geneticky neupravenými, infikovány standardním postupem E. amylovora ve třech nezávislých pokusech. Vyhodnocení přítomnosti nekrózy ukázalo, že oproti kontrolám (původní odrůdy i transgenní, ale needitované) byla u editovaných linií vysoce průkazně snížena frekvence výskytu nekróz, což prokazuje jejich nižší citlivost k patogenu. Například pro původní citlivou odrůdu Gala se procento nekróz pohybovalo v rozmezí 81 % ± 10 %, zatímco pro editované linie V1-6 a V1-10 bylo výrazně nižší (44 % ± 18 % a 35 % ± 11 %). U editovaných linií odrůdy Golden Delicious byl trend obdobný. Pro linie V2-3, V4-28 a V4-34 bylo procento nekrotických symptomů shledáno na úrovních 35 % ± 12 %, 40 % ± 15 % a 42 % ± 11 %, zatímco pro linii V4-7 bylo ještě nižší (25 % ± 11 %). Dalším významným výstupem z těchto experimentů bylo zjištění, že u editovaných linií obou odrůd docházelo v době sběru dat (21. den od inokulací rostlin patogenem) k přerušení rozvoje nekrózy a vývoji nových stonků bez příznaků nekrózy. Oproti tomu u kontrolních rostlin pokračoval nepříznivý vývoj onemocnění.

Tato práce, stejně jako některé z předchozích obdobně zaměřených studií potvrzuje, že cílená mutageneze vybraných genů prostřednictvím systému CRISPR/Cas9 je perspektivním nástrojem také pro šlechtění ovocných dřevin odolných vůči závažným patogenům, jako např. jabloní se sníženou citlivostí k bakteriální spále růžovitých.

Aktualizace ke dni: 27.3.2025