Jak upravit geny přírodních mistrů manipulace – bakteriofágů

30.1.2023 |

CRISPR, technologie editace genů oceněná Nobelovou cenou, může opět výrazně ovlivnit mikrobiologii a medicínu. Vědecký tým vedený průkopnicí CRISPR technologie Jennifer Doudna a její dlouholetou spolupracovnicí Jillian Banfield vyvinul nástroj pro úpravu genomů virů infikujících bakterie (bakteriofágů) pomocí vzácné formy CRISPR. Článek popisující tuto práci byl nedávno publikován v časopise Nature Microbiology. Vědci charakterizovali schopnost jedné varianty Cas13a omezit rozsáhlé fágové infekce v modelové bakterii Escherichia coli. Výsledky poukazují na zranitelnost molekul fágové RNA během fágové infekce a poskytují robustní zobecnitelnou strategii pro fágové genomové inženýrství.

První zdokumentované pozorování, které lze spojit s aktivitou fágů, pochází z roku 1896, kdy Ernest Hankin zjistil, že voda z řek Gangy a Jamuny v Indii měla antibakteriální aktivitu vůči bakteriím Vibrio cholerae, což naznačovalo přítomnost určité neidentifikované látky, která omezovala šíření epidemie cholery. V roce 1910 pak Felix d‘Herelle pozoroval v „bakteriálních trávnících“ zřetelné kruhové zóny, pro něž zavedl termín "plaky". Dále zjistil, že tyto jasné zóny způsobují viry, které parazitují na bakteriích, a pojmenoval je "požírači bakterií" - bakteriofágy.

Bakteriofágy (zkráceně fágy) jsou nejpočetnějším biologickým objektem v biosféře. Vyskytují se na všech místech osídlených jejich bakteriálními hostiteli. Genetický materiál je tvořen RNA nebo DNA. Bakteriofágy vkládají svůj genetický materiál do bakteriálních buněk pomocí nástroje podobného injekční stříkačce a poté se zmocní proteinového systému svého hostitele, aby se samy rozmnožovaly. Bakterie přitom obvykle zabíjejí, pro ostatní organismy (včetně lidí) jsou ale neškodné, i když snímky z elektronového mikroskopu ukazují, že vypadají jako přistávací modul mimozemské lodě.

Systémy CRISPR-Cas propůjčují prokaryotům různorodou antivirovou a antiplazmidovou adaptivní imunitu řízenou RNA. Proteiny CRISPR-Cas13 jsou nukleázy řízené RNA, kterým se bakterie brání proti příchozím RNA a DNA fágům tím, že se vážou na komplementární transkripty cílových fágů. Systém se skládá z krátkých úseků RNA, které jsou komplementární k sekvencím v genech fágů, což umožňuje mikrobům rozpoznat, kdy do nich byl vložen invazivní genetický materiál, a z enzymů fungujících jako nůžky, které neutralizují geny fágů tím, že je rozstříhají na neškodné kousky poté, co je RNA navede na specifické místo fágové DNA.

Vzhledem ke koevolučním závodům ve zbrojení mezi fágy a jejich cílovými bakteriemi fágy kódují přímé a nepřímé inhibitory systémů CRISPR-Cas, využívají strategie kompartmentalizace nebo maskování DNA a manipulují se systémem opravy DNA. Kromě toho fágy používají strategie na úrovni populací, aby zahltily či dokonce zničily nativní dráhy CRISPR. Tento soubor aktivních a pasivních obranných mechanismů DNA velmi ztěžuje použití jakéhokoli jediného efektoru CRISPR zaměřeného na DNA jako nástroje pro sekvenční úpravu genomu fágů.

Podle člena výzkumného týmu Benjamina Adlera mají fágy mnoho způsobů, jak se vyhnout obraně, od anti-CRISPRů až po to, že jsou efektivní v opravování své vlastní DNA. V jistém smyslu jsou adaptace zakódované v genomech fágů, díky nimž  dokáží manipulovat s mikroby, přesně tím samým důvodem, proč bylo tak obtížné vyvinout univerzální nástroj pro editaci jejich genomů.

Vedoucí projektu Jennifer Doudna a Jill Banfield od roku 2008, kdy poprvé spolupracovaly na počátečním výzkumu CRISPR, společně vyvinuly řadu nástrojů založených na CRISPR. Doudna a její vědecký tým z Berkeley Lab a Kalifornské univerzity v Berkeley studovali vlastnosti vzácné formy CRISPR nazvané CRISPR-Cas13 (odvozené od bakterie běžně se vyskytující v lidských ústech) a zjistili, že tato verze obranného systému funguje proti obrovskému množství fágů. Účinnost CRISPR-Cas13 v boji proti fágům byla neočekávaná vzhledem k tomu, jak málo mikrobů jej používá. Vědci byli také překvapeni tím, že fágy, které při testování tento systém porazil, všechny infikovaly bakterie pomocí dvouvláknové DNA, ale CRISPR-Cas13 se zaměřuje a štěpí pouze jednovláknovou virovou RNA. Stejně jako jiné typy virů mají některé fágy genom založený na DNA a některé na RNA. Tým zjistil, že systém CRISPR se může bránit proti různým fágům na bázi DNA tím, že se zaměří na jejich RNA poté, co byla vytvořena z DNA vlastními enzymy bakterií před tvorbou bílkovin. Systém CRISPR-Cas13 účinně neutralizoval devět různých DNA fágů, které všechny infikují kmeny E. coli, ale jejich genomy si nejsou téměř vůbec podobné. Dále tým prokázal, že systém lze použít i k úpravě genomů fágů.

Podle dalšího člena týmu, Vivek Mutalika, je tato práce na fágovém inženýrství jedním z vrcholných milníků v biologii fágů. "Vzhledem k tomu, že fágy ovlivňují mikrobiální ekologii, evoluci, populační dynamiku a virulenci, má jednodušší inženýrství bakterií a jejich fágů hluboké důsledky pro základní vědu, ale také má potenciál skutečně změnit nejrůznější aspekty bioekonomiky. Kromě lidského zdraví může mít tato schopnost fágového inženýrství dopad i na zemědělství a výrobu potravin," řekl Mutalik.

Jaký mohou mít fágy vliv na lidské zdraví? Jako antibakteriální prostředek byly využívány více než sto let, ale po objevu a širokém používání antibiotik se od nich víceméně upustilo. Celosvětový výskyt a vysoká prevalence bakterií rezistentních vůči antimikrobiálním látkám (antimicrobial-resistant, AMR) vedly k oživení zájmu o zapomenutou antibakteriální léčbu pomocí fágů (fágová terapie) jako o alternativní přístup k boji proti AMR bakteriím.

Rychlý pokrok, kterého bylo v poslední době dosaženo v oblasti molekulární biologie a genetického inženýrství, urychlil generování produktů souvisejících s fágy s vynikajícím terapeutickým potenciálem proti bakteriálním infekcím. V Česku se této problematice věnují například pracovníci institutu CEITEC Masarykovy univerzity či Přírodovědecké fakulty Masarykovy univerzity.

Schopnost snadno upravovat fágy s vlastním designem - která výzkumné komunitě dlouho unikala - by mohla výzkumníkům pomoci kontrolovat mikrobiomy bez antibiotik nebo škodlivých chemikálií a léčit nebezpečné infekce rezistentní vůči lékům. V současné době se rozvíjí také technologie založená na fázích pro mnoho účelů, včetně těch, které přesahují rámec antibakteriální léčby, jako je potlačení virů pomocí fágů, genová terapie, vývoj vakcín atd. Samotný tým Jennifer Doudna pracuje nyní na rozšíření systému CRISPR, aby jej mohli použít na více typů fágů. Využívají jej také jako nástroj ke zkoumání genetických záhad v genomech fágů. Kdo ví, jaké další úžasné nástroje a technologie mohou být inspirovány mikroskopickou válkou mezi bakteriemi a viry?

 

Zdroje: