Kontrola alternativního sestřihu pomocí dCasRx-RBM25: Efektivní a specifická modulace exonů
30.9.2024 | Petr Žák
Vědci torontské univerzity využili bakteriální imunitní obranný systém známý jako CRISPR k účinnému a přesnému řízení procesu tzv. sestřihu RNA, jež hraje klíčovou roli v produkci a rozmanitosti proteinů v lidském těle (blíže vysvětleno níže). Jelikož nesprávná regulace sestřihu může vést k různým závažným chorobám, jsou zapotřebí spolehlivé metody, které by umožnily odhalit biologické funkce a napravit nesprávnou regulaci různých izoforem proteinů. Technologie vyvinutá kanadskými vědci, označovaná jako dCasRx-RBM25, otevírá dveře novým aplikacím, včetně systematického zkoumání funkcí částí genů a opravování nedostatků v sestřihu. Studie byla zveřejněna v časopise Molecular Cell.
Nedávné objevy a inženýrství CRISPR systémů zaměřených na RNA (zejména CRISPR-Cas13d) významně rozšířily možnosti cílené manipulace transkriptomu (tj. souhrnu všech RNA vznikajících v buňce). Jeden typ CRISPR systému, pocházející z bakterie Ruminococcus flavefaciens, CasRx, se také zaměřuje právě na RNA, což umožňuje manipulaci s genovou expresí na úrovni transkriptů. CasRx je tedy možné využít pro specifické zásahy do RNA bez zásahu do genomu, což je užitečné například právě pro ovlivnění sestřihu mRNA. dCasRx, katalyticky deaktivovaná verze CasRx, dokáže efektivně potlačovat alternativní sestřih exonů blokováním splicingových míst. Ačkoli byla v některých případech prokázána také schopnost dCasRx stimulovat zahrnutí exonů, účinná a obecná aktivace exonů touto metodou nebyla dosud demonstrována.
V této studii autoři spojili dCasRx s 341 lidskými proteiny - sestřihovými faktory (což představuje přibližně 75 % známých lidských sestřihových faktorů). Tím vytvořili nástroj, který dokáže nejen specificky cílit na konkrétní RNA (díky gRNA), ale také aktivovat nebo potlačovat sestřih specifických exonů tím, že přivede příslušný regulační faktor na cílové místo RNA. Každou tuto fúzi testovali na dvou různých luciferázových sestřihových reportérech ve dvou různých savčích buněčných liniích. Celkem 44 z těchto dCasRx-fúzí aktivovalo sestřih v jednom z reportérů a pět z nich v obou. Jako nejúčinnější aktivátor/inhibitor byl identifikován dCasRx-RBM25, který vykazoval lepší výsledky než dříve popsané fúze. dCasRx-RBM25 dokáže efektivně s vysokou mírou přesnosti aktivovat i potlačovat sestřih exonů, a to jak na úrovni jednotlivých exonů, tak i u více exonů najednou.
"Náš nový efektorový protein aktivoval alternativní sestřih přibližně 90 procent testovaných cílových exonů," uvedl Jack Daiyang Li, první autor studie a doktorand molekulární genetiky, který pracuje v laboratořích Benjamina Blencoweho a Mikko Taipaleho v Donnellyho centru pro buněčný a biomolekulární výzkum na U of T. "Důležité je, že je schopen současně aktivovat a potlačovat různé exony a umožňuje tak zkoumat jejich kombinované funkce." Tato víceúrovňová manipulace usnadní experimentální testování funkčních interakcí mezi alternativně sestřihanými variantami genů s cílem určit jejich kombinovanou roli v kritických vývojových a chorobných procesech.
"Tento nástroj umožňuje širokou škálu aplikací, od studia funkce a regulace genů až po potenciální nápravu sestřihových defektů u lidských poruch a onemocnění," uvedl Dr. Blencowe, hlavní řešitel studie, vedoucí katedry kanadského výzkumu v oblasti biologie a genomiky RNA, Banburyho katedry lékařského výzkumu a profesor molekulární genetiky v Donnellyho centru a na Temertyho lékařské fakultě." Je také důležité poznamenat, že cílové exony jsou tímto sestřihovým faktorem ovlivněny s pozoruhodně vysokou specifičností, což zmírňuje obavy z možných účinků mimo cíl," uvedl třetí autor Mikko Taipale, který je také zároveň hlavním řešitelem studie.
Výzkumníci tedy mají nyní v ruce nástroj, který jim umožní systematicky prověřovat alternativní exony a určovat jejich roli v přežívání buněk, specifikaci buněčných typů a genové expresi. Kdyby se tento nástroj dostal do klinické praxe, může být potenciálně využit k léčbě mnoha lidských poruch a onemocnění, jako je autismus a rakovina, u nichž je sestřih často narušen. Tady je hlavním omezením dCasRx-RBM25 je jeho relativně velká velikost (219 kDa), což může ztěžovat terapeutické dodání pomocí metod, jako jsou adeno-asociované viry (AAV). Alternativní možnosti, jako jsou lipidové nanočástice nebo použití dvojitých AAV, mohou být však schůdné. Velikost dCasRx-RBM25 neomezuje jeho použití pro základní biologický výzkum, kde mohou být využity vektory jako PiggyBac transpozonový systém nebo lentiviry.
Závěrem - autoři studie identifikovali a charakterizovali dCasRx-RBM25 jako univerzální, účinný a vysoce specifický nástroj pro modulaci alternativního sestřihu exonů. Jeho hlavní výhody spočívají v tom, že působí na RNA, vyhýbá se nevratným změnám genomu a nevyžaduje přítomnost specifických PAM sekvencí, čímž překonává omezení jiných metod, jako jsou CRISPR-nukleázy. Díky své vysoké specifitě a účinnosti nabízí dCasRx-RBM25 nové možnosti pro biomedicínský výzkum a potenciálně i pro terapeutické aplikace při léčbě onemocnění spojených s nesprávným splicingem.
Obr.: a) Funkční screening fúzí dCasRX-splicing faktorů; b) Silná a specifická aktivace a represe endogenních exonů pomocí dCasRx-RBM25; c) Multiplexní modulace exonů
Vysvětlení problematiky alternativního sestřihu:
V molekulární biologii existuje základní princip, který se často označuje jako "centrální dogma", který popisuje normální tok genetické informace v buňkách: DNA → RNA → protein. Proces začíná transkripcí, kdy se z DNA vytváří molekula RNA, (konkrétně mRNA, messenger RNA), která přenáší genetickou informaci z jádra do cytoplasmy buňky. Zde dochází k translaci, kdy mRNA slouží jako šablona pro tvorbu proteinů, klíčových stavebních a funkčních jednotek buněk.
Počet genů v lidském genomu se stále jen odhaduje, uvádí se hodnoty 20 000 až 25 000 genů. To by teoreticky znamenalo, že by lidské tělo mohlo produkovat stejné množství různých proteinů. Ve skutečnosti však lidské buňky dokáží díky procesu zvanému alternativní sestřih (alternativní splicing) produkovat mnohem více různých proteinů, než je samotných genů. Alternativní sestřih totiž umožňuje, aby z jednoho genu vzniklo více variant mRNA tím, že se některé exony (části konkrétního genu kódující proteinů) zahrnou nebo vynechají. Tento proces tedy vede k produkci různých izoforem proteinů, které mohou mít odlišné funkce či se mohou vyskytovat v různých tkáních. Alternativní sestřih je tedy klíčový pro rozmanitost proteinů v lidském těle a díky tomuto procesu může být počet proteinů, které lidské tělo produkuje, mnohem vyšší než počet genů – odhaduje se, že jich mohou být až stovky tisíc. Tato variabilita je důležitá pro správnou funkci organismu, od vývoje a diferenciace buněk až po složité procesy, jako je imunitní odpověď nebo fungování nervového systému. U řady genů však není funkce jednotlivých exonů nebo intronů jasná. Je ale známé, že nesprávná regulace alternativního splicingu může vést k různým chorobám, včetně rakoviny nebo neurodegenerativních onemocnění.
Z těchto důvodů jsou zapotřebí metody pro efektivní a přesnou manipulaci alternativních izoforem, které by umožnily odhalit jejich biologické funkce a také napravit jejich nesprávnou regulaci při onemocněních. Zatím se používají například antisense oligonukleotidy (ASOs), které cílí na určité úseky v pre-mRNA (tzv. cis-elementy) - ty se ukázaly být účinné jak při potlačování (např. cílením na sestřihová místa), tak při aktivaci (např. cílením na sestřihové silenční elementy) alternativních exonů a jsou v současnosti používány i v klinické praxi. Nicméně, účinky ASOs jsou dočasné a vyžadují pracné experimenty k určení účinných sekvencí, což je činí nevhodnými pro vysoce průchodné studium funkcí exonů. Existují i další přístupy, ale i ty mají inherentní omezení, jako je neschopnost aktivovat exony (CRISPR-Cas genomická delece), snížená cílová specificita (PUF-ESFs), narušení celkové exprese transkriptů (izoforma-specifické RNAi a ExSpeU1s) a nedostatek obecné použitelnosti pro specifické cílení (malé molekuly).