Výzkumníci z Pioneer Hi-Bred International a DuPont Pioneer vyvinuli kukuřici NLB18 odolnou proti onemocnění zvanému severní skvrnitost listů kukuřice (spála kukuřice, NLB). NLB je choroba způsobená patogenní houbou Exserohilum turcicum (dříve známá jako Helminthosporium turcicum). V počáteční fázi infekce jsou na listech napadených plísní skvrny s typickým šedozeleným lemem, později pak velké, podlouhlé nekrotické léze ve tvaru doutníku. Silně napadené porosty vypadají jako by byly popálené. NLB napadá kukuřici rostoucí na polích po celém světě. Pokud dojde k infekci před kvetením, může onemocnění vést ke ztrátám na výnosu zrna přesahujícím 50 %, což z něj činí jednu z nejdestruktivnějších houbových chorob kukuřice. Hlavním způsobem kontroly NLB je pěstování odolných kultivarů kukuřice.

U rostlin geneticky upravené kukuřice NLB18 bylo provedeno nahrazení citlivé alely genu nlb18 rezistentní alelou ze stejného lokusu. K odstranění citlivé alely nlb18 byly použity dvě naváděcí gRNA nukleasy Cas9. Jedna byla zacílena na rozpoznání sekvence v promotoru genu nlb18 a druhá na jeho 3’UTR (nepřekládaná oblast mRNA). Současně byla dodána opravná templátová DNA, která kódovala rezistentní alelu nlb18 (res) a opravovala dvouřetězcový zlom způsobený cílenou mutagenezí pomocí technologie CRISPR. 

Rezistentní alela nlb18 (res) kóduje kinázu podobnou receptoru asociovanému s buněčnou stěnou, která se podílí na rozpoznávání patogenu a buněčné signalizaci. Je důležitou součástí vrozeného imunitního systému rostliny, který vnímá elicitory, jež jsou v rostlinné biologii často asociovány s rostlinnými patogeny a škůdci. Tyto elicitory se mohou vázat na specifické receptorové proteiny lokalizované na plazmatických membránách rostlinných buněk. Receptory jsou schopny je rozpoznat a iniciovat intracelulární obrannou signalizaci, což má za následek zvýšenou syntézu sekundárních metabolitů. Tyto metabolity minimalizují poškození a zvyšují odolnost rostliny vůči škůdcům, chorobám nebo environmentálnímu stresu. Tento proces je klíčový pro udržení rostlinné homeostázy a přežití v nepříznivých podmínkách. Rezistentní alela nlb18 (res) tedy kóduje kinázu, která hraje klíčovou roli v rezistenci hostitele proti houbovým patogenům. 

Kukuřice NLB18 byla vytvořena pomocí úpravy CRISPR/Cas biolistickou transformací se sedmi plazmidy. K výběru finální linie rostlin, která obsahuje alelu nlb18 (res) odolnou vůči chorobě v jejím nativním genomovém lokusu a neobsahuje žádnou další vloženou nezamýšlenou sekvenci plazmidové DNA, byly použity šlechtitelské postupy i charakterizace sekvenováním nové generace. Výzkumníci použili Southern-by-Sequencing analýzu, což je robustní screeningový přístup pro molekulární charakterizaci geneticky modifikovaných odrůd rostlin. Tímto způsobem bylo potvrzeno, že kukuřice NLB18 obsahuje jen změnu ve vědci vybrané genomové sekvenci zvyšující její odolnost proti patogenní plísni.

Aktualizace ke dni: 25.7.2024