Nová varianta CRISPR/Cas9 rozšiřuje možnosti editace genomu
26.4.2021 |
V současné době je velmi rozšířený výzkum zaměřený na vývoj a úpravy metod editace genomu. Walton et al. (2020) ve své studii popsali novou variantu nástroje pro editaci genů CRISPR/Cas9 nazvanou SpRY. SpRY odstraňuje bariéry toho, co může a nemůže být „zacíleno“ při editaci genů, takže téměř jakákoliv genomová sekvence v rostlinách může být místem pro cílené úpravy. Účinnost SpRY byla ověřena týmem čínských a amerických vědců v následné studii nedávno publikované v časopise Nature Plants (Ren et al., 2021).
CRISPR/Cas9 a PAM sekvence
CRISPR/Cas9 je jednoduchý dvousložkový systém, který umožňuje vědcům upravit téměř jakoukoli sekvenci v genomu organismu. Zaměření na konkrétní místo v genomu je dosaženo pomocí tzv. „naváděcí RNA“ (guide RNA, gRNA), která rozpoznává cílovou sekvenci a následně ji ve spolupráci s CRISPR-asociovanou endonukleázou (Cas) štěpí.
Vědci z celého světa, kteří tuto technologii využívají, se při návrzích svých systémů setkávají s jedním důležitým pojmem - sekvence PAM.
Co je to PAM a proč je důležitá při navrhování a využívání CRISPR experimentů? CRISPR/Cas systém je prokaryotický imunitní systém, zajišťující obranu bakterií vůči cizím genetickým elementům, jako jsou plazmidy nebo fágy (bakteriální viry). Bakteriální organismus tyto exogenní genetické elementy rozpozná a deaktivuje je (enzymaticky je „rozřeže“). Jak je ale zajištěno, že fragment virového genomu zabudovaný do bakteriálního genomu (CRISPR oblast) nespustí takovou reakci, při níž by Cas9 rozřezal „vlastní“ bakteriální genom?
Zajistí to právě PAM sekvence. Motiv sousedící s protospacerem (protospacer adjacent motif, PAM) je krátká sekvence DNA (obvykle o délce 2 až 6 párů bází) nezbytná pro štěpení Cas nukleázou a sousedí s oblastí DNA určenou ke štěpení CRISPR systémem. PAM sekvence se obecně nachází 3 – 4 nukleotidy po směru od místa štěpení dvoušroubovice DNA.
Vyskytuje se v napadajícím viru nebo plazmidu, nenachází se ale v genomu bakteriálního hostitele („bránící se“ bakterii) a není proto součástí bakteriálního lokusu (pozice daného genu na chromozomu) CRISPR. Cas9 se nemůže úspěšně navázat a následně štěpit cílovou sekvenci DNA, pokud za ní nenásleduje odpovídající sekvence PAM. PAM je tedy jednou ze základních cílících složek, stejně jako gRNA.
Místa v genomu, na která lze cílit při editaci pomocí CRISPR, jsou tedy determinována nutností přítomnosti PAM sekvencí specifických pro danou nukleázu. Nejčastěji používanou nukleasou je Cas9 ze Streptococcus pyogenes (SpCas9), která rozpoznává PAM sekvenci 5‘-NGG-3‘ (kde „N“ může být jakákoli nukleotidová báze).
Ale co když cílový genomový lokus nenese tuto NGG sekvenci, což se stává poměrně často např. v oblastech bohatých na obsah guaninu a cytocinu (GC)?
Vědci nechtějí být při využívání CRISPR omezeni nutností přítomnosti specifické sekvence PAM. Naštěstí existuje více různých Cas endonukleáz izolovaných z různých bakteriálních druhů a rozpoznávajících jinou PAM. Například SaCas9 (ze Staphylococcus aureus) specificky rozpoznává PAM sekvenci 5‘-NNGRR(N)-3‘. Vědci tedy mají možnost vybrat jinou nukleázu, jejíž odpovídající PAM může být přítomna v cílovém lokusu. Různé nukleázy mohou navíc nabídnout jiné zajímavé vlastnosti; jejich výběr je tak jedním z klíčových kroků při použití CRISPR systému. Přesto jsou však výzkumníky vyžadovány další strategie, které odstraní i zbylá stávající omezení a umožní upravovat genom na libovolném místě.
SpRY varianta CRISPR/Cas9
Práce Dr. Waltona a jeho kolegů může tento problém zcela změnit, protože umožní úpravy genů pomocí CRISPR/Cas9 v jakékoli sekvenci DNA.
Ve své studii Walton s kolegy geneticky upravili enzym SpCas9 - nejprve vygenerovali upravenou variantu SpCas9 nazvanou SpG; nově upravený SpG může cílit na rozšířenou sadu 5‘-NGN-3‘ PAM oblastí namísto pouze jediné 5‘-NGG-3‘ PAM. Tato změna umožnila systému CRISPR‑Cas9 upravovat čtyřnásobný počet genů oproti původnímu systému. Dále optimalizovali enzym SpCas9 na tzv. SpRY variantu, která dokáže akceptovat téměř všechny „PAM sekvence“ v genomu.
SpRY v podstatě odstraňuje bariéry toho, co může a nemůže být zacíleno při editaci genů, což umožňuje poprvé zacílit téměř jakoukoli genomovou sekvenci (i u rostlin) pro potenciální mutaci.
Editace rostlin s využitím SpRY
Čínští a američtí vědci (ve studii Ren et al., 2021) ověřovali nový systém SpRY při editaci genomu u rozličných PAM míst v rýži (zástupce jednoděložných rostlin) a u dahurského modřínu pomocí upravené varianty SpRY Cas9. Ukázalo se, že sada nástrojů SpRY opravdu překonává restrikční bariéru PAM i při genomovém inženýrství rostlin a umožňuje úpravy DNA bez závislosti na PAM.
Oprávněná je jistě obava, že díky uvolněným požadavkům na PAM mohou nově vytvořené SpG a SpRY potenciálně generovat více úprav, třeba i mimo cíl (off-target aktivita). K off-target aktivitě dochází dvěma mechanismy. První je daný podobností cílové sekvence s jinými místy v genomu, druhý může být výsledkem samovolné editace sgRNA vnášeného konstruktu. Tyto obavy však nebyly potvrzeny; vědci během provedených experimentů nenašli významné nebo znepokojivé důkazy o SpRY indukovaných mutacích v necílových sekvencích.
Studie Ren et al. (2021) tedy ukazuje, že SpRY umožňuje s minimálními vedlejšími účinky editovat téměř jakoukoliv sekvenci DNA, včetně editace jednotlivých bází, bez přísných restrikcí daných PAM sekvencemi. Tento průlom bude mít zásadní dopad na translační výzkum a šlechtění plodin. Nová varianta technologie CRISPR/Cas9 může být použita na různé druhy plodin, které pomohou při zabezpečení potravin, výživě a bezpečnosti tím, že urychlí vývoj plodin a další zemědělskou revoluci.
Zdroje:
https://www.isaaa.org/kc/cropbiotechupdate/article/default.asp?ID=18557
Zdroj obrázků:
https://cs.wikipedia.org/wiki/CRISPR_editace_genomu
https://www.cell.com/trends/genetics/fulltext/S0168-9525(20)30098-6