Produkce bionafty s využitím geneticky editovaných řas
5.1.2021 |
Vědci z univerzity v Hirošimě vyvinuli vysoce účinný systém pro editaci genomu mikrořasy Nannochloropsis oceanica, která může být zdrojem surovin pro produkci bionafty.
Řasy shromažďují v intracelulárních organelách vysoké koncentrace lipidů produkovaných fotosyntézou. Hlavními lipidy řas jsou triacylglyceroly (TAG), které lze převést na bionaftu methyl esterifikací mastných kyselin. Díky tomu mohou být TAG použity jako suroviny pro nové udržitelné zdroje energie.
Výroba bionafty z řas je však výrazně dražší než výroba paliv z fosilních zdrojů. Tato cenová bariéra by mohla být překonaná šlechtěním řas, které vykazují rychlý růst a vysokou produktivitu při tvorbě lipidů. Za tímto účelem probíhají různé studie molekulárního šlechtění řas pro efektivní výrobu bionafty.
Mezi druhy, které produkují vysoké množství lipidů, patří mikrořasy Nannochloropsis, eukaryotické sekundární symbiotické řasy. K dispozici jsou drafty genomových sekvencí několika druhů Nannochloropsis; japonští výzkumníci pracovali s kmenem N. oceanica NIES-2145.
Pro úpravu genomu jsou již delší dobu k dispozici velmi účinné a jednoduše použitelné nástroje. Dnes asi nejznámější je systém CRISPR-Cas, za jehož objevení byla v loňském roce udělena Nobelova cena. Tento systém byl použit i pro úpravu genomu druhů Nannochloropsis, ale ukázalo se, že nebude nejvhodnější volbou z důvodu jeho nízké účinnosti.
Kromě techniky CRISPR-Cas9 a jejích četných modifikací patří mezi nové techniky šlechtění metoda používající proteiny TALE (transcription-activator like effector) spojených s nukleázou (TALEN). TALEN systémy pracují na podobném principu jako CRISPR-Cas9, k vyhledání cílového úseku DNA ale místo krátkého řetězce RNA využívají speciálně syntetizované proteiny. TALE proteiny obsahují 34 aminokyselinových zbytků.
V dřívější studii byl systém TALEN použitý pro úpravu genomu rozsivek – pro narušení genu UDP-glukózo pyrofosforyláza. Vylepšený kmen produkoval lipidy se 45násobným zvýšením obsahu TAG ve srovnání s rodičovským kmenem kultivovaným za stejných podmínek. Účinnost takových mutací však nebyla příliš veliká, pohybovala se v rozmezí 7 – 56 %.
TALEN proteiny je možné modifikovat, a tím zvýšit jejich aktivitu. Výměnou 4. a 32. aminokyselinového zbytku byly vyvinuty vysoce aktivní TALENy, které jsou označované jako Platinové TALENy A právě ty použily vědci při svých experimentech, zaměřených na editaci genomu mikrořas.
Japonští výzkumníci pracovali se dvěma endogenními geny N. oceanica. Jedním z nich byl gen enzymu nitrátreduktáza, NoNR, který umožňuje vizuálně detekovat fenotyp s narušeným genem. Druhým byl gen LPAT1 kódující enzym biosyntetické cesty glycerolipidů.
Cílová místa pro Platinové TALENy v každém genu byla určena pomocí nástroje TAL Effector Nucleotide Targeter 2.0. Nejprve byly zkonstruovány páry savčích expresních vektorů Platinových TALENů zaměřených na oba geny a byla ověřena jejich aktivita v buňkách HEK293T. Po potvrzení jejich aktivity byly moduly vázající DNA vloženy do cílových vektorů („vše v jednom“ TALEN plazmidy) pro expresi v N. oceanica nesoucích N-terminální i C-terminální domény TALE a FokI, které byly optimalizovány pro kodon genomu N. oceanica NIES-2145. Platinové TALEN plazmidy byly následně zavedeny do buněk N. oceanica elektroporací.
Oba TALENy vykazovaly 100% mutační aktivitu, vysokou specifitu a multiplexovatelnost - současným zavedením TALENů zaměřených na dva geny byly získány dvojitě mutantní kmeny. Zatím nebyla v genomu analyzována off-target aktivita.
N. oceanica je jednou z nejdůležitějších řas akumulujících lipidy z kandidátů na výrobu suroviny pro produkci biopaliv. Výzkumníci věří, že jejich systém Platinum TALEN proto bude jednou ze základních technologií pro molekulární úpravy N. oceanica, a přispěje tak k vytvoření vysoce výkonných řas pro praktické využití.
Oblastí úpravy mikrořas prostřednictvím biotechnologií se v ČR zabývá i Centrum řasových biotechnologií ALGATECH, pracoviště Mikrobiologického ústavu AV ČR sídlící v Třeboni. Centrum aktuálně koordinuje téma „Využití mikrořas v potravinářství a produkčním zemědělství“ v rámci výzkumného programu Strategie AV21 Potraviny pro budoucnost. V tomto programu se konkrétně zaměřují na izolaci nových kmenů mikrořas, rozvoj metod modifikace dědičné informace řas a metod zvýšení řasové produkce i provozování Aplikační laboratoře řasových biotechnologií.
Zdroje:
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32888368/
https://www.isaaa.org/kc/cropbiotechupdate/article/default.asp?ID=18353 (vč. obrázku)