V souvislosti se změnou klimatu vyvstává v posledních desetiletích před výzkumníky a šlechtiteli rostlin velmi náročný úkol, jak urychleně zajistit odpovídající zemědělskou produkci pro neustále narůstající počet obyvatel naší planety. Díky významnému pokroku v možnostech úprav dědičné výbavy (genomu) zemědělských plodin, ať již vložením nebo odebráním některých genů technikami genetických modifikací (GM) či přímo prostřednictvím cílených úprav vybraných genů pomocí nových technik šlechtění (angl. New Breeding Techniques, NBT), se v současnosti nabízí velké množství biotechnologických přístupů, které by v komplexu s ostatními postupy mohly být podstatné pro úspěšnost řešení tohoto zásadního problému. Jednou z dílčích možností, která je nově ověřována, je záměrná změna počtu průduchů na listech rýže – plodiny, jež v současnosti zabezpečuje výživu více jak poloviny lidstva. To pomocí klasického šlechtění není schůdné.

Nedávné pokroky ve funkční genomice (určení konkrétních genů zodpovědných za danou vlastnost a poznání souvisejících regulací) rýže umožnily kupř. identifikovat nejdůležitější z genů, jež předurčují znaky týkající se listových průduchů (stomat), včetně řízení jejich velikosti a počtu. V této souvislosti se proto nabízela otázka, zda by také zde bylo možné využít pro další kroky osvědčenou techniku CRISPR/Cas, a to konkrétně k vytváření cílených mutací stomatálních genů a získání rostlin s požadovanými příznaky. Případné pozitivní výsledky by pak byly velice slibným předpokladem pro přesné řízení (nastavení) genetických parametrů klíčových znaků průduchů, a tudíž i dobrým příslibem pro využitelnost navržené strategie pro šlechtění rýže odolnější vůči převažujícím kritickým faktorům prostředí (jako jsou sucho, vysoké teploty, zasolení půd nebo naopak nadbytek vláhy), aniž by došlo ke snížení výnosů a kvality zrna. Tým indických badatelů ze státu Tamil Nadu jako jeden z průkopníků využil CRISPR/Cas9 k vytváření nových alel (forem) genu OsEPF1 pro faktor epidermální struktury listů rýže, o kterém je známo, že je negativním regulátorem počtu průduchů/ jejich hustoty na listu u oblíbené odrůdy rýže ASD16. Autoři prokázali, že již u mutantních linií T₀ generace, tj. přímo ovlivněných CRISPR/Cas9, došlo ke zvýšení hustoty průduchů o 3,7-44,3 % oproti kontrole. Ještě výrazněji se mutace projevovaly u homozygotů v T₁ generaci vzniklé samosprášením T₀ linií. Současně u homozygotních linií T₁ vzrostla výměna plynů zprostředkovaná průduchy, rychlost fotosyntézy a výpar vody. Stávající výsledky tak potvrzují perspektivnost navržené strategie šlechtění rýže odolné změnám klimatu.

Co motivovalo výzkumníky k návrhu a následnému ověření této alternativní cesty šlechtění rýže pomocí NBT? Vysvětlení je poměrně jednoduché. Vznik průduchů na listech byl v evoluci patrně jednou z prvních adaptací rostlin při jejich přechodu z vody na souš, proto, aby vůbec byly schopné přežít v nových podmínkách. Je také známo, že rostlinné druhy žijící v podmínkách extrémního sucha mají na rozdíl od svých příbuzných výrazně nižší počet průduchů, aby výpar/ztráty vody byly co nejnižší. Naopak rostliny rostoucí v podmínkách nadbytku vody mívají vysoký počet stomat, které často ani neuzavírají.

Typické rostlinné průduchy sestávají ze dvou svěracích buněk, které uzavírají průduchovou štěrbinu, kterou může docházet k výměně plynů mezi rostlinou a jejím okolím, ale i k výparu vody. Uzavírání či otevírání průduchů je také nástrojem k regulaci fotosyntézy. Je tedy patrné, že průduchy jsou pro rostliny velmi důležitou strukturou, která vyžaduje velmi citlivé regulace ke sladění všech jejích funkcí. 

Největšími hrozbami pro zvyšování produkce rýže jsou z klimatických faktorů sucho a vysoká teplota. Předpovědi vývoje klimatu naznačují, že stále častěji bude docházet k extrémnímu vývoji počasí, čímž bude nepříznivě ovlivněna i produkce rýže. Zvýšení počtu/hustoty průduchů na listech rýže může přispět k vyšším ztrátám vody, a tudíž napomoci procesu ochlazování při výparu vody z rostliny, a tak zmírnit ztráty výnosu zrna v důsledku nepříznivé vysoké teploty. Právě ta se v posledních letech stala hlavním faktorem omezujícím výnosy rýže, zejména pokud se projevuje v průběhu kvetení a plnění zrna. 

V posledních dvaceti letech se vědcům podařilo ověřit funkci genů uplatňujících se při vývoji a rozmístění průduchů. Jedná se o geny náležící do rodin Epidermal Patterning Factor (EPF1, EPF2) a Epidermal Patterning Factor-Like (EPFL9/Stomagen), které kódují malé sekreční mobilní peptidy regulující vývoj průduchů a vzory jejich rozmístění. U rýže zvýšená exprese genu OsEPF1 pro negativní regulátor počtu průduchů snižuje hustotu průduchů (SD) a jejich vodivost. Linie rýže s takto sníženým počtem/hustotou průduchů vykazovaly lepší účinnost ve využití vody a lépe se vyrovnávaly se suchem. Naopak mutanty s defektním OsEPF1 vykazovaly vyšší hustotu průduchů, která zvyšovala jejich vodivost a účinnost fotosyntézy. Na druhé straně k vyšší hustotě průduchů vede i zvýšený projev genu OsEPF9, který je pozitivním regulátorem SD. Neméně zajímavé je, že vyřazení (knockout) genu OsEPF10 vedlo u rýže ke snížení SD, a to bez jakéhokoliv dopadu na vodivost průduchů a zabudování uhlíku při fotosyntéze.

Indičtí výzkumníci po cílené mutagenezi genu OsEPF1 u rýže ASD 16 uskutečnili u 17 rostlin T₀ generace jeho sekvenční analýzu. Zjistili mimo jiné, že u všech takto pozměněných linií rostlin docházelo k cíleným mutacím v prvním exonu (1. kódující části genu). Jednalo se buď o ztráty vazebných párů bází (bp) v rozsahu 1 až 7 bp nebo naopak se začleněným(i) 1-2 bp. K uvedeným změnám došlo v jedné, dvou nebo i více alelách daného genu. U všech 17 linií T₀ generace byla také vyhodnocena SD na obou stranách listu. Ve srovnání s původní linií ASD 16 mělo šest linií vyšší SD, jak na svrchní (ke stonku orientované) straně listu, tak i na spodní straně. Celkově však byly hodnoty SD vyšší na svrchních stranách listů než na spodních površích. Nejvyšší nárůst SD na svrchní straně listů (o 44,3 %) byl zaznamenán u linie #E1-1, u které byla také oproti kontrole průkazně vyšší SD i na spodní straně listů. U tří mutantních linií došlo naopak ke snížení SD, což bylo spojeno s nižší hustotou pruhů listových průduchů, ve kterých se u trav vyskytují a také nárůstem velikosti průduchů. Obecně platí, že s nižší SD se velikost průduchů zvětšuje a naopak.

Výzkumníci také sledovali dědičnost změněných znaků průduchů u rostlin T₁ generace, konkrétně u potomstva linie E1-1 s mutacemi ve dvou alelách (+1 bp/-1 bp). Hodnoceno bylo celkem šest potomstev, které byly porovnávány s nemodifikovanou kontrolou. Sekvenční analýza genu OsEPF1 odhalila tři linie (# E1-1-4, # E1-1-9 a # E1-1-11), které vykazovaly homozygotní mutaci – zvýšení (inzerci) jednoho páru bází (+1/+1 bp) v každé alele genu OsEPF1. Zbývající tři linie (#E1-1-1, #E1-1-3 and #E1-1-6) byly v obou mutacích heterozygotní (+1/-1 bp). Ukázalo se, že všechny tři homozygotní linie T1 generace měly oproti kontrole ASD 16 průkazně vyšší počet průduchů, např. linie # E1-1-11 dokonce o 95 % na svrchním povrchu listů, což bylo doprovázeno odpovídajícím snížením velikosti průduchů o 50-64 % na svrchní straně a o 35-48 % na spodní straně. 

U T₁ mutantních potomstev s homozygotní mutací (+1/+1 bp) uskutečnili autoři práce také analýzu fyziologických parametrů (vodivost průduchů, rychlost fotosyntézy, rychlost transpirace – vypařování vody povrchem listů). Uvedené mutantní linie vykazovaly oproti netransgenní kontrole o 60-65 % vyšší vodivost průduchů, vyšší u všech tří linií byla i rychlost transpirace (o 58-62 %). Rychlost fotosyntézy u linie # E1-1-11 s oběma nejvyššími uvedenými parametry byla o 31 % vyšší než u kontroly. Zajímavé jsou také výsledky korelační analýzy. Narůstající hustota průduchů se pozitivně projevovala v dalších třech parametrech (vodivosti průduchů, rychlosti fotosyntézy a výparu vody). Oproti tomu, podle předpokladu, hustota průduchů negativně korelovala s jejich velikostí. Nepříznivé je, že u tří výše uvedených mutantních linií je v důsledku žádoucího vyššího výparu vody listy o 20-29 % snížena účinnost hospodaření s vodou („cena za ochlazení“) oproti netransgenní kontrole.

Získané výsledky jsou velmi nadějné pro další výzkumnou práci a možnosti praktického využití. Vzhledem k novosti této studie je ale třeba ještě realizovat další související pokusy, které budou např. zaměřeny na prokázání skutečnosti, že u pěstovaných mutantních rostlin rýže dochází k ochlazování mikroklimatu pod příkrovem listů jejich nadzemní části a k toleranci vyšších teplot.

V případě úspěšnosti přístupu by využívání takto upravených odrůd rýže významně přispívalo ke zvýšení výnosů rýže a jejich stabilizaci u rýže pěstované za nepříznivých podmínek vysoké teploty.

Aktualizace ke dni: 28.11.2024