Rýže setá (Oryza sativa L.) patří mezi celosvětově nejvýznamnější zemědělské plodiny. Představuje hlavní zdroj potravy pro téměř polovinu lidstva naší planety. Jen v Asii jsou na konzumaci rýže odkázány více jak dvě miliardy lidí. Nejčastěji využívanou formou této potraviny je loupaná rýže, která obsahuje především škrob (kolem 90 %). Škrob sestává z polymerů glukosy, a to amylosy a amylopektinu, jež vznikají prostřednictvím vazeb mezi uhlíky α-1,4 a α-1,6 molekul glukosy. Amylosa vytváří jen zřídka vazby α-1,6 a vykazuje i nižší stupeň polymerizace (SP), zatímco amylopektin představuje vysoce větvený polysacharid s velkou molekulou a vyšším SP. Při chladnutí vařených potravin se molekuly amylosy rychle znovu spojují za tvorby gelu nebo sraženiny, které vytváří komplexy odolné vůči trávení. Oproti tomu molekuly amylopektinu reasociují pomalu, a proto jsou vytvořené komplexy snáze stravitelné. Potraviny s vysokým podílem amylosy mají tedy vyšší obsah škrobu odolného k trávení (rezistentního škrobu, RS). Právě obiloviny s vysokým obsahem amylosy a RS nabízí potenciální zdravotní benefity.

Díky poznatkům získaným při chemické mutagenezi a RNA interferenci (jednoho z principů genového inženýrství využívaného k potlačení či umlčení projevu genů) se ukázalo, že hlavní roli v určování struktury a fyzikálních vlastností škrobu mají enzymy zodpovědné za tvorbu postranních řetězců, „větvení“, u obou polymerů, angl. označované jako: „starch branching enzymes - SBE“. Zůstávalo však výzvou, jak řídit větvení polymerů ve škrobu u běžných komerčních linií rýže. Společný tým vědců z Čínské akademie zemědělských věd v Pekingu, Čínského národního výzkumného ústavu rýže v Hangzhou, University of Liege v Gembloux a University of California v La Jolle použil technologii CRISPR/Cas9 k cílené mutagenezi dvou vybraných variant genů zodpovědných za větvení molekul škrobu  ̶  SBEI a SBEIIb a získání homozygotních linií sbeI a sbeII rýže. Díky tomu byly získány významné poznatky o funkcích obou genů a vlivech na vlastnosti škrobu rýže. Vůbec poprvé se tak podařilo dokázat možnost získání rýže s vysokým obsahem amylosy pomocí CRISPR/Cas zprostředkované editace genu SBEII.

Neinfekční chronické choroby související s nesprávnými stravovacími návyky, jako jsou kardiovaskulární onemocnění, diabetes a některá nádorová onemocnění tlustého střeva a konečníku jsou v současnosti hlavními příčinami úmrtnosti jak v rozvinutých zemích, tak zemích třetího světa. Kvalifikované odhady předpokládají, že v r. 2035 bude na naší planetě cukrovkou postiženo kolem 600 milionů lidí. Jednou z cest ke zlepšení lidského zdraví a snížení rizika těchto závažných neinfekčních chorob je zvýšení konzumace obilovin s vysokým obsahem RS. Zrna obilovin s vyšším obsahem amylosy jsou vždy jeho dobrým zdrojem. RS není stravitelný ani absorbován v žaludku a v tenkém střevu, a obdobně jako rozpustná (zdravá) vláknina prochází přímo do tlustého střeva a také obdobně působí. Napomáhá ve výživě probiotických bakterií ve střevech, a tak zvyšuje tvorbu zdraví prospěšných mastných kyselin s krátkým řetězcem, jako např. kyseliny máselné. Vyšší obsah amylosy a tím také RS ve škrobu se rovněž odráží v nižším glykemickém indexu (GI), o kterém je známo, že ovlivňuje lidské zdraví. Potraviny s nízkým GI jsou pomaleji absorbovány a pomáhají udržovat hladinu krevního cukru v rovnováze. Pozitivní účinky na řízení hladiny cukru v krvi vykazují jak z krátkodobého, tak dlouhodobého hlediska. Tím preventivně působí proti různým chronickým chorobám. Příznivě upravují také koncentraci lipidů v krvi a zabraňují dalším komplikacím při cukrovce.

Těchto pozitivních účinků vyššího obsahu amylosy a RS na lidské zdraví si byli dr. Sun se spolupracovníky dobře vědomi, a proto se pokusili nalézt vhodnou alternativu k časově i materiálově velmi náročné šlechtitelské práci. Záměrně se rozhodli pro techniku editace předem vytipovaných SBE genů zprostředkovanou CRISPR/Cas9, která umožňuje přesně cílit zásahy do jejich DNA, a to současně i v obou variantách téhož genu, alelách. S cílem dosáhnout co možná nejvyšších obsahů amylosy a RS v zrnech vhodně pro svou práci zvolili japonskou odrůdu Kitaake, která je varietou rýže seté (Oryza sativa L., var. japonica). Odrůdy této variety, na rozdíl od rozšířenější var. Indica, mají přirozeně poněkud vyšší obsah amylosy a RS ve škrobu zrn, což má mj. vliv i na její varné a senzorické vlastnosti (chuť, vůni).

Pro úpravy genů SBEI a SBEIIb výzkumníci zvolili mírně upravený plazmidový vektor pCXUN-Cas9, jehož součástí byl i selektovatelný gen hpt, pro odolnost k antibiotiku hygromycinu, který umožňuje snadno provádět již na úrovni kalusových kultur (typ buněčných kultur, ze kterých lze opět získat celé rostliny) výběr buněk s odpovídajícími vlastnostmi. Do vektoru byly vloženy různé expresní kazety pro naváděcí molekuly RNA (gRNA) zacílené vždy na jeden z genů. Následně byly tyto vektory vneseny elektroporací do bakterií Agrobacterium tumefaciens kmene EHA105, které po kolonizaci buněk rýže zprostředkovaly aktivaci příslušné kazety a zavedení DNA upravujícího enzymu na cílové místo. Z kalusů rostoucích na půdách s hygromycinem byly po jejich přenosu na regenerační médium získány zelené rostliny, které byly podrobeny molekulárním analýzám.

Vybraní homozygotní jedinci byly samosprášeni a rostliny následné generace (T1) byly použity pro další analýzy. Předmětem zájmu byly jak běžné šlechtitelské parametry (jako tvar a velikost zrn, váha tisíce zrn apod.), ale i podrobnější údaje o tvaru a struktuře škrobových zrn, složení škrobu v mouce, podílu RS, analýzy distribuce délky řetězců amylopektinu, ale i stravitelnosti rýžové mouky zkumavkovým testem a další charakteristiky.

Mezi nejdůležitější výsledky patří zjištění, že celkový obsah škrobu v zrnech tzv. bílé rýže, tj. zbavené osemení u obou mutantních linií sbeI a sbeIIb byl srovnatelný s jeho obsahem u výchozí odrůdy (kontroly). Mutované linie získané editací genu sbeIIb však vytvářely zrna s výrazně vyšším obsahem amylosy (25 %) než obdobně mutované linie sbeI a původní odrůda (15 %). Všechny mutované linie sbeIIb měly také pozměněnou délkovou distribuci (hlavních) řetězců zbavených postranních řetězců. V amylopektinu mutantních linií sbeIIb byly průkazně více zastoupeny delší řetězce a odpovídajícím způsobem méně byly přítomny řetězce kratší. Změnily se také fyzikálněchemické a výživové charakteristiky škrobu obou typů mutovaných linií. Např. obsah RS v čerstvě uvařených zrnech mutantů sbelIb dosahoval až 9,8 % zatímco u mutantů sbeI a kontroly byl minimální až nulový. Dále obsah redukujících cukrů, který pozitivně koreluje s GI byl u sbeIIb mutantních linií daleko nižší oproti výchozí odrůdě, oproti tomu mutanty sbeI se v tomto ohledu od kontroly nelišily. Významné je, že obsah pentosanů, které jsou vnímány jako jedna z hlavních složek zdravé vlákniny, byl u mutantů sbeIIb průkazně vyšší než u kontroly, zatímco rozdíly mezi mutanty sbeI a kontrolou nebyly výrazněji odlišné.

Na základě získaných výsledků dospěli autoři k jednoznačnému závěru, že pro získání zdravějších typů rýže se zvýšeným obsahem amylosy, RS a dalšími souvisejícími zdravotními benefity je vhodné dále využívat techniku editace genu SBEII, případně jeho kombinace s genem SBEI. Přestože dosud zjištěné poznatky poukázaly na některé negativní průvodní účinky stávajících typů úprav genu SBEIIb, jako například menší velikost/ hmotnost zrn, nižší výnosy, zhoršení chuťových vlastností, pozdější práce dalších čínských (2019) a taiwanských (2021) týmů jednoznačně potvrdily správnost orientace na cílené úpravy genu SBEII. Novější, šlechtitelsky zaměřené projekty, např. publikované v r. 2022 Miurou, ukázaly, že např. u linií rýže s vysokým obsahem RS lze poměrně snadno pomocí zpětných křížení s elitními šlechtitelskými liniemi průvodní nepříznivé vlastnosti překonat, a přitom udržet získané zdravotní benefity mutantů.

Aktualizace ke dni: 1.3.2024