Světlo, kamera, CRISPR: Editace genomu pro uložení krátkého filmu do DNA živých bakterií

19.8.2017 |

Setha Shipman s kolegy (Lékařská fakulta Harvardovy univerzity v Bostonu) použili populární nástroj molekulárních biologů tzv. CRISPR/Cas pro kódování černobílých obrázků a následně i krátkého filmu v genomu střevní bakterie Escherichia coli. Tento systém nazvali CRISPR klip. Při jeho přípravě využili schopnosti hostitelského organismu zachytit fragmenty DNA z invazivních virů a uložit si je do organizovaného lokusu ve svém genomu. Práce dokazuje, že CRISPR klipy můžou zachytit a trvale uchovávat množství reálných údajů v genomech živých buněk.

CRISPR/Cas pochází z anglického clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated genes (segmenty nahromaděných pravidelně rozmístěných krátkých palindromických repetic/CRISPRu asociovaných genů). Jedná se o adaptabilní imunitní systém některých bakterií, a především archeí, za pomoci kterého se dokáží bránit virovým infekcím. Specifická obrana je umožněna díky předchozí konfrontaci s cizorodým genetickým materiálem (např. virem), při které buňka získala informaci o daném patogenu ve formě krátké sekvence DNA, již si ve podobě tzv. mezerníku (spaceru) uložila do své vlastní DNA v oblasti CRISPR lokusu. Při dalším setkání se stejným patogenem může buňka spustit silnou obrannou odezvu a příslušnou cizorodou DNA bez problému degradovat. Celý princip je tedy vlastně obdobou RNA interference u eukaryotních organismů. Využití tohoto systému pak molekulárním biologům umožňuje vložit informace do genomu živé buňky.

Právě vkládání mnoha krátkých spacerů (mezerníků) do CRISPR lokusu výzkumníci při tvorbě CRISPR klipů využili, přičemž jednotlivé mezerníky pak vlastně odpovídaly pixelům vytvářeného obrazu. Hodnota jasu pixelu, spolu s čárovým kódem určujícím jeho pozici ve vytvářeném obrazu, byla zakódována v sekvenci DNA dlouhé 33 bází. Tyto sekvence byly prostřednictvím elektroporace vloženy do populace bakterií, které obsahovaly CRISPR lokus a zároveň nadměrně exprimovaly Cas1-Cas2 integrasu. Takto uložená data, v podobě sekvencí DNA, byla následně zpětně získána prostřednictvím vysoce výkonného sekvenování (tzv. high-throughput sekvenace). Vložené fragmenty DNA pak byly převedeny (dekódovány) do podoby původního obrázku (viz obrázek).

Práce byla publikována v časopisu Nature a prvním obrázkem vytvořeným živými bakteriemi E. coli byl digitalizovaný černobílý snímek pravé ruky. Tento motiv si výzkumníci nezvolili náhodně - měl připomínat prehistorické malby vytvořené na stěnách jeskyní. Po necelých třech hodinách po elektroporaci bakterie vytvořily obrázek shodný s předlohou, který byl stabilně kódován v jejich genomu po dobu minimálně jednoho týdne. K tvorbě obrázku vědci použili dvě strategie. První, rigidní, využívala 4 odstíny. Druhá, flexibilní, pak 21 možných odstínů.

V další části práce se Shipman s kolegy vrhli na vytvoření krátkého filmu složeného ze série pěti snímků. Záběr zachycoval běžícího koně, který je poctou sérii pohybových vysokorychlostních fotografií anglického fotografa Eadwearda Muybridge, konkrétně cyklu „Animal Locomotion“ z roku 1887. Každý jednotlivý snímek vytvořeného filmu je složen ze 104 fragmentů DNA a pro jeho tvorbu byla využita flexibilní strategie. Elektroporace snímků do bakterií probíhala v časovém odstupu jednoho dne. Použité čárové kódy určující pozici pixelu ve snímku byly shodné pro všechny snímky. Pro určení pořadí snímku ve filmu nebyly použity žádné další nukleotidové sekvence. Bylo využito faktu, že sekvence DNA nově vkládané elektroporací, tedy v tomto případě nový snímek, jsou skoro vždy vloženy nejblíže vedoucí sekvenci CRISPR lokusu.

Shipman s kolegy, mezi kterými byl i známý genetik George Churche, učinili krok směrem k vytvoření mobilního záznamového systému využívajícího živých buněk. Publikovaná práce rovněž odhaluje dosud neznámé principy v přirozeném fungování CRISPR/Cas, včetně sekvence určující přidání mezerníku, které jsou významné pro pochopení biologické podstaty bakteriální adaptace i její praktické využití.

Obrázek: Schématické znázornění strategie použité pro záznam snímku do bakteriálního genomu.

Zdroje:

Shipman, S. L.; Nivala, J.; Macklis, J. D. & Church, G. M. (2017): ‘CRISPR–Cas encoding of a digital movie into the genomes of a population of living bacteria‘, Nature advance online publication; doi:10.1038/nature23017; https://www.nature.com/nature/journal/v547/n7663/full/nature23017.html (13.08.2017).

Kolibová S.; Stehlíková Z.; Zdeňková K. (2017): CRISPR/Cas9 REVOLUČNÍ NÁSTROJ NEJEN PRO EDITACI GENOMU, Bioprospect č. 2/2017; http://bts.vscht.cz/sites/default/files/Bioprospect_c2_2017.pdf (13.08.2017)