Vědci vyvinuli jednoduchou a efektivní metodu přípravy TALE konstruktů

23.3.2021 |

Transkripční aktivátorová efektorová nukleáza (TALEN) představuje populární a široce používanou technologii pro úpravy genomu. Přestože se jedná o již zavedenou metodu, vědci se snaží o její zjednodušení a zpřístupnění pro širší aplikace.

Odborníci z Capital Medical University v Pekingu nyní vyvinuli jednoduchou, nízkonákladovou a efektivní metodu pro sestavení TALE konstruktu pomocí systémů dvou sad primerů (řetězců nukleové kyseliny o délce několika bází sloužících jako počáteční místo replikace nukleové kyseliny). Metoda byla publikována v časopise BioTechniques.

Obecný princip metody TALEN spočívá v tom, že TALENy účinně rozpoznávají a štěpí DNA v požadované místě. Funkční protein TALEN obsahuje řadu (opakování) stejných 34 aminokyselinových zbytků uspořádaných do tandemu. Liší se pouze aminokyselinové zbytky 12. a 13. (tzv. RVD oblast, Repeat Variable Diresidue), které určují rozpoznávanou DNA bázi.

Funkční konstrukt TALEN obvykle obsahuje 15–20 těchto opakování sestavených v definovaném pořadí podle cílového místa štěpení (je tedy nutná komplementarita 15-20 nukleotidů) u každého TALENu. Restrikční endonukleasa FokI štěpí jeden řetězec DNA, celý systém tak vyžaduje komplementaritu 30-40 nukleotidů, což výrazně snižuje šanci pro nespecifickou (off-target) aktivitu.

Přestože TALENy mají řadu zajímavých schopností (např. až pětkrát vyšší účinnost při editaci heterochromatinu než CRISPR/Cas9 nebo možnost využití pro selektivní eliminaci mitochondriálních mutací), současné metody syntézy TALE jsou však relativně komplikované nebo drahé. Nejčastěji používanou klonovací strategií je Golden Gate assembly, pomocí níž lze ligovat (spojovat) více fragmentů DNA v definovaném pořadí. K tomu se využívá sada připravených plazmidů nabízených ve formě kitu různými firmami. Postup této strategie je zobrazen níže na schématu 1.

Alternativně lze TALEN sestavit i pomocí klonování nezávislém na ligaci (spojování dvou fragmentů DNA). Tyto metody jsou ale stále poměrně komplikované nebo nákladné. Celý postup trvá několik dní, takže je zde potřeba vývoje jednoduché a nenákladné metody přípravy TALEN.

Vědci z Capital Medical University v Pekingu pro syntézu TALE konstruktů využili denaturační/renaturační povahu dvouvláknové DNA. Pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) došlo k vytvoření jedinečných „lepivých“ (kohezních) konců pomocí dvou sad primerů. Touto již dříve popsanou metodou „Twin-Primer Assembly (TPA)“ lze sestavovat fragmenty amplifikované (zmnožené) pomocí PCR bez použití enzymů, bez fosforylovaných nebo dlouhých oligonukleotidů a bez omezení sekvence. Dvojice primerů je využita k vytvoření komplementárních kohezivních konců na TALE monomerech, jak je znázorněno a pospáno v níže uvedeném schématu 2.

Jednoduchý postup nevyžaduje další post-PCR enzymatické ošetření a nezahrnuje místa restrikčních enzymů ani modifikované primery. Tato, na dvojitých primerech založená, strategie by tedy mohla být užitečným doplňkem vlastní přípravy TALEN.

Pro ověření metody autoři úspěšně syntetizovali dva páry TALENů zaměřených na endogenní lokus (pozice daného genu na chromozomu) TET1 v lidských embryonálních ledvinových buňkách a následně prokázali jejich účinnost. Potvrdili tak, že metoda poskytuje alternativní jednoduchou a nízkonákladovou variantu pro efektivní přípravu TALEN konstruktů a může zjednodušit použití TALE technologie.

Zdroje:

https://www.isaaa.org/kc/cropbiotechupdate/article/default.asp?ID=18559

https://www.future-science.com/doi/pdfplus/10.2144/btn-2020-0130